DNA芯片分析
轉錄組研究使用惡臭假單胞菌芯片；該芯片包含5539個基因特異性寡核苷酸（50聚體），一式兩份點樣到γ-氨基硅烷處理的25×75 mm顯微鏡載玻片上，并通過紫外線和加熱固定。將惡臭假單胞菌DOT-T1E、T1E-18和T1E-PS28在LB培養基中過夜培養，用于接種含或不含300μM吲哚的新鮮培養基；培養物在30°C孵育至660 nm處濁度達到0.5-0.6（指數期），收集細胞并立即進行RNA提取。使用TRI試劑（Trizol）/BCP（1-溴-3-氯丙烷）法分離RNA，隨后制備熒光標記的cDNA；雜交條件和數據收集按先前描述進行。采用LOWESS強度依賴性歸一化方法對數據進行歸一化，使用Almazen系統軟件進行統計分析；采用學生t檢驗計算P值，當倍數變化≥2且P值≤0.05時，認為基因差異表達。芯片數據已存入Array Express數據庫（http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress），登錄號為E-MEXP-3819、3822、3823和3824。
流式細胞術HPF熒光實驗
使用5μM熒光報告染料HPF，PMT（光電倍增管）電壓設置如下：E00（FSC）、360（SSC）和825（FL1）；使用FACSDiva 6.0軟件處理和分析流式數據。所有實驗中，細胞過夜培養后以1:1000稀釋到25 mL含5μM HPF的LB培養基中，燒瓶在避光搖床中30°C、200轉/分鐘孵育；在指數生長期早期添加抗生素（詳見結果部分），在添加藥物前（0時刻）和3小時后取樣；在這些時間點收集約10^7個細胞，洗滌一次并重懸于過濾后的PBS（pH 7.2）中，然后進行熒光測量。
Bioscreen生長曲線分析
從添加10μg/mL利福平的LB平板上挑取新鮮培養的惡臭假單胞菌DOT-T1E和DOT-T1E-18單菌落，在液體LB培養基中30°C過夜培養；將培養物重懸于15 mL液體LB培養基中，調整至660 nm處吸光度為0.1。在微孔板的每個孔中加入190μL液體LB培養基或170μL大腸桿菌LK111過濾上清液（均添加200μg/mL氨芐西林），以及10μL重懸培養物；對于大腸桿菌上清液，添加20μL 10×LB培養基。陽性對照孔為接種DOT-T1E菌株的液體LB培養基，陰性對照孔為不含細胞的培養基。使用FP-1100-C型Bioscreen C MBR分析儀系統在30°C連續振蕩條件下監測生長；在24小時內，每60分鐘使用420-580 nm邊帶濾光片測量濁度。每個菌株對每種測試化合物至少進行三次實驗，每次實驗后目視檢查平板以驗證結果。
實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）
RNA提取按先前描述進行，實時PCR擴增在MyiQ2系統上進行，結合iQ5光學系統軟件（版本2.1.97.1001）。每個25μL反應混合物包含12.5μL iQ SYBR綠色超混合液[100 mM KCl、40 mM Tris-HCl（pH 8.4）、0.4μM每種dNTP、iTaq DNA聚合酶（50 U/mL）、6 mM MgCl2、SYBR綠色I、20 nM熒光素和穩定劑]、0.4μM每種引物和2μL模板cDNA（稀釋10倍或1000倍）。熱循環條件如下：95°C 10分鐘（1個循環），然后95°C 15秒、61.1°C或61.7°C（分別用于吲哚和氨芐西林實驗）30秒、72°C 20秒（40個循環），每個循環進行一次熒光測量（按制造商建議）；最后進行72°C 1分鐘的延伸循環。PCR產物長度在132-350 bp之間；熔解曲線分析通過將PCR混合物從55°C逐步加熱至95°C（每10秒升溫0.5°C，共80個循環）進行。基因的相對表達水平以16S rRNA為內參基因進行歸一化，結果采用比較閾值循環（ΔΔCt）法分析。
結果
利用熒光染料分析惡臭假單胞菌對抗生素的響應
在惡臭假單胞菌DOT-T1E菌株中，某些殺菌化合物（氨芐西林、諾氟沙星）和抑菌化合物（氯霉素、四環素、紅霉素）的主要排出機制是通過RND外排泵實現的。本研究監測了野生型惡臭假單胞菌DOT-T1E及其ttgABC敲除突變體（T1E18）、ttgGHI敲除突變體（T1E-PS28）和雙突變體ttgABC/ttgGHI（T1E-PS32）（表1）在暴露于氨芐西林、諾氟沙星（殺菌化合物）以及氯霉素、紅霉素、四環素（抑菌抗生素）后的細胞生長停滯、細胞死亡和3'-對羥基苯基熒光素（HPF）熒光淬滅情況。
首先，我們測定了四種菌株對上述五種抗生素的最低抑菌濃度（MIC）。結果顯示，T1E-PS28的MIC與野生型DOT-T1E一致（表2），而兩種TtgABC缺陷菌株（T1E-18和T1E-PS32）對抗生素的敏感性顯著提高（表2）。對于抑菌化合物，300μg/mL氯霉素、400μg/mL紅霉素或8μg/mL四環素可抑制野生型菌株生長，但在整個實驗過程中（3小時）細胞存活率保持100%（氯霉素的結果見圖1A）；對于TtgABC突變體，70μg/mL氯霉素即可抑制生長，而雙突變體在更低濃度下生長就會受到抑制（表2），但實驗過程中細胞仍存活。
對于殺菌化合物，這類抗生素首先抑制細胞生長，3小時后由于細胞裂解，存活細胞數量減少兩個數量級。親本菌株DOT-T1E和PS28菌株在625μg/mL氨芐西林或2μg/mL諾氟沙星作用下表現出上述效應；T1E-18和T1E-PS32在更低濃度的這兩種殺菌化合物作用下即可停止生長，隨后發生細胞死亡。
吲哚是TtgV的效應物，而TtgV是調控ttgGHI表達的抑制子。我們推測，由于TtgGHI泵參與抗生素排出，吲哚存在時惡臭假單胞菌DOT-T1E的抗生素耐藥性可能增強。我們在有吲哚存在的條件下，對親本菌株及ttgABC、ttgGHI和ttgABC/ttgGHI突變體重復了MIC實驗（見表2）。結果顯示，DOT-T1E和T1E-PS28（ttgGHI突變體）在有無吲哚存在時的抗生素耐藥模式相似，無顯著差異（表2）；T1E-PS32雙突變體在有無吲哚存在時均比親本菌株對抗生素的耐藥性更低；而T1E-18菌株在吲哚存在時表現出更強的抗生素耐藥性，這表明在缺乏TtgABC的情況下，吲哚依賴性TtgGHI誘導對耐藥性具有重要作用。
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