已有研究利用熒光染料HPF監測抑菌化合物誘導的體內熒光淬滅，我們進行了類似實驗：在添加50%MIC濃度藥物3小時后監測HPF熒光，該濃度和時間可保證野生型和突變體菌株100%存活。結果顯示，氯霉素（圖1B）、紅霉素和四環素等抑菌化合物不會引起惡臭假單胞菌及其突變體的HPF熒光淬滅，這與大腸桿菌的實驗結果一致；野生型DOT-T1E在氨芐西林（圖1C）和諾氟沙星作用下出現HPF熒光淬滅。我們還檢測了T1E-18、T1E-PS28和雙突變體T1E-PS32的HPF熒光淬滅響應：100μg/mL氨芐西林即可誘導DOT-T1E-18的淬滅反應（圖1I），該濃度是野生型菌株發生淬滅所需最低濃度的1/3；雙突變體T1E-PS32在更低濃度（1/15）下即可誘導HPF熒光淬滅（圖1L）。這些結果表明，盡管基于HPF淬滅模式和親本菌株及突變體T1E-PS32的耐藥性特征，TtgGHI外排泵在氨芐西林排出中的作用較弱（圖1），但仍需將氨芐西林排出功能歸因于TtgGHI——因為ttgABC/ttgGHI雙突變體在遠低于T1E-18的氨芐西林濃度下即發生HPF熒光淬滅，且對多種抗生素的敏感性更高。
殺菌化合物并非通過產生活性氧殺死惡臭假單胞菌DOT-T1E
已有研究表明，體內羥基自由基可淬滅HPF熒光；曾有觀點提出大腸桿菌中殺菌抗生素通過產生羥基自由基發揮普遍殺傷機制（無論其具體細胞靶點如何），依據是殺菌化合物（而非抑菌化合物）處理的細胞中會出現HPF熒光淬滅。但近期研究反駁了這一解釋，發現殺菌抗生素在無氧條件下仍可殺死大腸桿菌；與此一致，另有研究發現大腸桿菌并非對所有殺菌化合物都產生活性氧。
我們的結果顯示，惡臭假單胞菌中殺菌和抑菌化合物引起的HPF熒光淬滅模式與上述大腸桿菌模式相似。我們進一步檢測了氨芐西林處理后細胞是否激活氧化應激響應程序：通過轉錄組分析和實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）分析多個氧化應激基因的表達，提取暴露于300μg/mL氨芐西林的DOT-T1E細胞總RNA并進行全局表達分析。結果顯示，氨芐西林處理后57個基因表達上調，22個基因表達下調，但未發現氧化應激相關基因在氨芐西林存在下被調控；相反，與一般應激相關的基因（如recA和lexA）被誘導表達。為進一步驗證芯片結果，我們通過qRT-PCR定量分析了烷基氫過氧化物酶（T1E_5238）、過氧化氫酶（T1E_3279和T1E_4765）、過氧化氫酶過氧化物酶（T1E_1753）和recA基因的誘導水平：氨芐西林存在下生長的細胞中氧化應激基因未被誘導（相對表達水平為0.88-1.4），而recA的表達上調了6倍。在對氨芐西林敏感性增強的惡臭假單胞菌DOT-T1E18中，氨芐西林處理也未誘導氧化應激基因表達。這些結果表明，氨芐西林不會導致活性氧（ROS）產生，也不會誘導氧化應激基因表達，但會誘導一般應激響應相關基因。
吲哚是種間信號分子
DOT-T1E的基因組分析未發現色氨酸酶同源物。為驗證DOT-T1E是否通過其他途徑產生吲哚，我們通過高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）分析了惡臭假單胞菌DOT-T1E在含或不含色氨酸的基礎培養基中生長后的培養上清液，未發現惡臭假單胞菌產生吲哚的跡象；而在大腸桿菌LK111的平行對照實驗中，大腸桿菌在進入穩定期早期時產生的吲哚濃度可達400μM。
由于吲哚被描述為種內信號分子，我們進一步檢測了大腸桿菌與惡臭假單胞菌突變體共培養是否會影響該土壤細菌的抗生素耐藥性：在含色氨酸的LB培養基中培養大腸桿菌LK111及其同基因tnaA（色氨酸酶）突變體，將過濾后的培養上清液作為吲哚來源，通過抑菌圈實驗檢測其對DOT-T1E、T1E-18和T1E-PS28抗生素耐藥性的影響（圖2）。
結果顯示，親本菌株（圖2A）和T1E-PS28（圖2A和C）在有無大腸桿菌培養上清液存在時的抗生素耐藥性水平相似；在無培養上清液或添加tnaA突變體上清液時，T1E-18的抑菌圈大于親本菌株，這種差異在替卡西林、氨芐西林和氯霉素作用下尤為顯著（圖2）；而添加大腸桿菌LK111上清液后，T1E-18對所有抗生素的耐受性增強，耐藥性水平與添加純吲哚時相當。這表明腸桿菌產生的吲哚可有效促進惡臭假單胞菌的抗生素耐藥性，通過監測惡臭假單胞菌的生長曲線進一步證實：200μg/mL氨芐西林可抑制DOT-T1E18的生長，而添加大腸桿菌上清液可緩解這種抑制效應（盡管細胞進入對數期前存在短暫延遲，且生長速率比無抗生素時慢20%）（圖3）。
隨后，我們檢測了惡臭假單胞菌野生型、DOT1E-18與產吲哚大腸桿菌菌株在有無抗生素存在時的體內生長情況：將大腸桿菌與各惡臭假單胞菌菌株以相同細胞密度（10^5 CFU/mL）接種到不含抗生素或含氨芐西林的LB培養基中，以各菌株單獨接種作為對照；通過在LB+氨芐西林+鏈霉素（大腸桿菌選擇性培養基）上涂布計數大腸桿菌細胞數量，在LB+利福平上計數DOT-T1E，在LB+利福平+卡那霉素上計數T1E-18。結果顯示，8小時后共培養物達到穩定期；在對照培養物和各共培養物中，大腸桿菌細胞密度均約為10^8 CFU/mL，DOT-T1E或T1E-18的細胞數量與之相近，表明無抗生素存在時各菌株的適應性相當。我們在300μg/mL氨芐西林存在下重復了上述共培養實驗：大腸桿菌因質粒pMRS101攜帶bla基因而對該藥物耐藥，DOT-T1E菌株主要通過TtgABC泵排出抗生素而耐藥，而T1E-18菌株的生長則受氨芐西林抑制（見圖4）；結果顯示，只有當培養基中存在大腸桿菌LK111時，T1E-18才能在氨芐西林存在下生長（圖4），表明種間信號傳導具有功能活性，且惡臭假單胞菌可通過識別大腸桿菌產生的化學信號在含抗生素的培養基中增殖。
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