摘要
能夠生物合成特異性角蛋白酶的角蛋白分解微生物因其在角蛋白廢棄物管理中的潛在應用而成為科學關注的主題。在幾個細菌類別中，放線菌仍然是角蛋白降解菌株的最重要來源之一，然而微球菌科的成員就其應用性角蛋白分解潛力而言很少受到仔細研究。從禽類羽毛廢棄物中分離測試的微球菌屬B1pz被鑒定為藤黃微球菌（M.luteus）。該菌株在含有1-2%雞羽毛和酵母提取物補充劑的培養基中生長，產生32 KU的角蛋白酶和較低水平的蛋白酶（6 PU）。它能夠有效分解羽毛或表皮角質層的"軟"角蛋白，而其他"硬"毛發型角蛋白則不然。產生的角蛋白分解酶主要是堿性絲氨酸或硫醇蛋白酶的混合物，在最適pH 9.4、55°C下具有活性。在粗培養液中鑒定出四種主要的蛋白酶組分，分子量分別為62、185、139和229 kDa。對還原因子輔助作用的研究表明，還原性硫化合物可用于在角蛋白的酶消化過程中增強角蛋白分解，而不是在培養條件下。所展示的藤黃微球菌分離株表現出顯著的角蛋白分解潛力，這決定了其在禽類副產品生物降解或角蛋白基飼料成分配制方面的可行應用能力。
引言
積累角蛋白廢棄物的全球性問題（主要是作為屠宰場副產品）引發了對涉及多種角蛋白分解微生物的生物利用手段的科學興趣。這種方法為當前采用的涉及高能耗技術或有毒試劑的生物轉化方法提供了一種建設性替代方案。許多報告涉及放線菌角蛋白分解酶的主題，然而，絕大多數集中在鏈霉菌科成員，其中鏈霉菌屬仍然是大量角蛋白酶生產者的無限來源。盡管如此，已知幾種不太常見的放線菌表現出顯著的角蛋白分解潛力。Thys等人描述的短小桿菌屬（Microbacterium sp.）kr10，在以羽毛粉作為唯一營養源的情況下生長，據報道能在嗜溫溫度下產生角蛋白分解蛋白酶。一項詳細調查揭示了一種42 kDa、含Zn2?、Mg2?的金屬蛋白酶，對酪蛋白、白蛋白和角蛋白具有最高特異性。純化的角蛋白酶在2-巰基乙酸鹽存在下能有效水解天然角蛋白。如Mitsuiki等人所示，嗜堿的Nocardiopsis sp.TOA-1在脫脂牛奶/酵母提取物培養基上生長，生物合成了一種高度穩定的角蛋白分解酶，其最適活性在pH 11.0-11.5和70-75°C溫度下。這種20 kDa的絲氨酸蛋白酶對角蛋白表現出高特異性活性，對酪蛋白的活性較低。
從幾個禽類養殖場來源的篩選放線菌中，Saha等人獲得了一種羽毛降解的Nocardiopsis sp.SD5，能夠在高度堿性條件下，在淀粉/酪蛋白培養基上培養4天內，有效利用角蛋白（45-50°C）。粗角蛋白酶提取物對天然羽毛顯示出巨大的活性。酶譜分析揭示了30 kDa和60 kDa兩種蛋白水解組分的存在。也有關于新型角蛋白分解放線菌屬于Amycolatopsis或Actinomadura屬的報告。普遍存在的微球菌屬細菌是已知的細胞外絲氨酸或硫醇蛋白酶以及彈性蛋白酶的生產者。
然而，微球菌細菌的真正角蛋白分解潛力很少被提及和被低估。雖然一些致病菌株負責某些皮膚感染，但其他菌株可以作為角蛋白分解酶的寶貴來源或有助于角蛋白廢棄物管理。密切相關的玫瑰色庫克菌（Kocuria rosea）經Bernal等人深入研究，是羽毛誘導角蛋白酶的杰出生產者的例子。該菌株在含有3%羽毛的批次培養物中，在補充了酵母提取物的優化礦物質培養基中，于40°C下生物合成角蛋白分解和酪蛋白分解蛋白酶。玫瑰色庫克菌的獨特特性使作者能夠設計一個發酵過程，以提高廢棄羽毛的生物價值，用作動物飼料成分。
角蛋白的微生物分解已知不僅由特定的蛋白水解酶進行，還涉及負責底物中二硫鍵斷裂的還原因子。硫化合物如亞硫酸鹽或硫化物，以及二硫鍵還原酶，已知是此過程的一部分（Yamamura et al.，2002;Prakash et al.，2010;Cedrola et al.，2012）。因此，研究微生物生長環境中還原因子的存在，以及補充二硫鍵還原劑在改善角蛋白分解中的可行性變得至關重要。
本研究旨在通過評估角蛋白酶生產條件、角蛋白生物降解能力、粗培養液中蛋白酶和角蛋白酶的初步表征，以及研究還原因子在角蛋白分解增強中的作用，來評估微球菌屬B1pz細菌的角蛋白分解潛力。
材料與方法
細菌菌株和分子系統發育研究
該細菌菌株在先前的研究中從波蘭弗羅茨瓦夫附近的家禽加工廠的羽毛廢棄物中分離，并保藏于波蘭弗羅茨瓦夫環境與生命科學大學生物技術與食品微生物學系的本地菌種保藏中心。從營養肉湯（葡萄糖10 g/L；營養肉湯8 g/L）的24小時液體培養物中，使用GeneMATRIX細菌和酵母基因組DNA純化試劑盒（Eurx）提取基因組DNA。使用以下通用引物通過聚合酶鏈式反應（PCR）擴增16S rRNA基因：（27 F）AGAGTTTGATCGTGGCTCAG和（1492L R）GGTTACCTTGTTACGACT。PCR反應混合物（50μL）包含：25μL Taq PCR Master Mix（2x）（Eurx）；每種引物20 pmol和基因組DNA 1mu g。
PCR程序包括：94°C初始變性5分鐘，隨后進行35個循環：94°C變性1分鐘，53°C退火30秒，72°C延伸90秒，最后72°C延伸10分鐘。PCR產物從反應組分中純化，并使用引物：27 F、1492L R和一個額外的內部引物CTCCTACGGGAGGCAGCAG（357 F）進行測序。獲得的序列提交至核糖體數據庫項目（RDP）第10版。使用MAFT版本6和Archaeopteryx版本0.972+進行序列比對和系統發育研究。
角蛋白材料
實驗中使用的角蛋白是各種皮膚附屬物，如白雞羽毛、白鴕鳥羽毛的羽枝和羽軸、豬鬃、羔羊毛、人發和表皮角質層（s.c.）。底物通過用甲醇-氯仿溶液（1:1）洗滌和脫脂制備。
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