結果
本研究所采用的關于VTEC（產志賀毒素大腸桿菌）在發酵生肉制品（FRMS）生產與貯藏相關環境條件下響應的數據，涵蓋了多種血清型與菌株。盡管數據生成條件多樣，且涉及大量不同的血清型與菌株，但我們的聯合數據集呈現出良好的一致性趨勢。所構建的模型已成功通過新的實驗觀察結果以及來自文獻和公共數據庫的獨立數據進行了驗證。
模型開發
(i)生長速率模型
模型預測的生長速率與在不同溫度、pH和水分活度（a_w）條件下觀測到的生長速率進行了比較。基于這三個環境因子構建的核心模型，進一步通過引入未解離乳酸濃度的影響項進行了擴展，該擴展項的參數擬合基于本研究生成的數據。表2列出了所估計的模型參數值。與先前對單核細胞增生李斯特菌的報道類似，我們在大腸桿菌中也觀察到，生長速率的自然對數所受的抑制與未解離乳酸濃度成正比，且此關系獨立于pH或總乳酸濃度。
表2 - 模型系數估計值與標準誤表2 模型系數估計值與標準誤| 模型、建模量及方程 | 系數或其他參數 | 估計值 | 標準誤 (SE) |
|---|---|---|---|
| 最大比生長速率 (μmax), ln(μmax), 方程 4 | a0 | -9.95 | 1.25 |
| a1 | 0.188 | 0.0584 | |
| a2 | 1.89 | 0.253 | |
| a3 | -3.65 | 4.22 | |
| a12 | 0.0290 | 0.00789 | |
| a13 | -0.279 | 0.0955 | |
| a23 | 4.55 | 0.572 | |
| a11 | -0.00514 | 0.000295 | |
| a22 | -0.223 | 0.0184 | |
| a33 | -131 | 8.81 | |
| a4 | -0.146 | 0.0167 | |
| RMSEa | 0.307 | - | |
| a RMSE, 均方根誤差。 | |||
| 非熱比滅活速率 (φ), ln(φ), 方程 5 | b0 | 23.4 | 1.96 |
| b1 | -8000 | 567 | |
| F | -1.51 | - | |
| b4 | 0.00796 | 0.000737 | |
| RMSE | 0.693 | - | |
| 熱比滅活速率 (τ), ln(τ), 方程 6 | c0 | -20.3 | 1.61 |
| c1 | 0.391 | 0.0281 | |
| RMSE | 0.267 | - | |
| 生長概率 (P), ln(P/(1-P)), 方程 7 | d0 | 21.3 | 1.26 |
| d3 | 7.38 | 0.468 | |
| d12 | 0.642 | 0.157 | |
| d13 | -0.583 | 0.0521 | |
| d23 | -0.496 | 0.121 | |
| d4 | 16.5 | - | |
| 一致性b | 97.2% | - | |
| AICc | 660 | - | |
|
b 預測概率與觀察響應之間的一致性。 c AIC, 赤池信息準則。 |
|||
(ii)生長概率模型
通過邏輯回歸方法，構建了描述生長概率對溫度、pH和a_w依賴關系的模型。采用向后回歸系數選擇法進行變量篩選，結果表明，初始包含的10個模型項中有5項不顯著，故將其從最終模型中剔除。模型系數見表2。該模型隨后通過引入第四個環境因子——未解離乳酸濃度的影響項進行了擴展。乳酸添加顯著改變了生長概率為0.5的預測邊界條件。在不含乳酸的情況下，生長/不生長的邊界pH值約為4；而當培養基中添加總乳酸濃度達到45,000 ppm時，邊界pH值上升至6。
為探究模型在不同乳酸濃度、溫度、pH和a_w組合下的性能，本研究生成了一套新的數據集。總體而言，包含乳酸影響項的擴展模型預測結果與獨立生成的生長/不生長數據吻合良好。估計擴展模型（含乳酸項）的預測與觀測響應之間的一致性百分比為86%，而原始模型（不含乳酸項）的一致性為77%。
(iii)存活/非熱滅活速率模型
在此上下文中，“存活”或“非熱滅活”特指在FRMS特有的環境條件下（即溫度以外的其他因素，如低pH或低a_w，阻止了大腸桿菌生長）菌群數量的衰減。為研究種群衰減速率對溫度、pH和a_w的依賴性而開發的核心模型表明，只有溫度對大腸桿菌的滅活速率具有顯著影響。因此，當其他因素（如低pH和/或低a_w）抑制大腸桿菌生長時，滅活速率主要依賴于溫度，并在較小程度上依賴于未解離乳酸濃度。這些抑制生長因素本身（pH和a_w）并非直接導致滅活速率變化的主因。
為研究未解離乳酸濃度對大腸桿菌非熱滅活的影響，我們生成了一套新的數據集，包含96條存活曲線，涉及兩種大腸桿菌血清型（O157:H7和O103:H25），在多種乳酸濃度、溫度、pH和a_w組合下進行。這兩種血清型滅活速率的比較表明，大腸桿菌O103:H25的衰減速率顯著高于O157:H7（P值<0.0001）。大腸桿菌O157:H7表現出更強的抗滅活能力，尤其是在低pH條件下。初始的非熱滅活模型在最苛刻條件下預測的滅活速率快于該菌株的實際觀測值。因此，我們對模型進行了修正，使其能夠基于本研究中發現的抗性最強的菌株（O157:H7）來預測VTEC的存活情況。修正方法是在模型中引入一個因子F，該因子根據模型預測值與O157:H7實測滅活速率之間的偏差計算得出。利用該菌株生成的數據也用于通過乳酸影響項擴展VTEC的非熱滅活模型。
本工作開發的非熱滅活速率模型與McQuestin等人的模型存在差異。這主要是由于本研究模型引入了校正因子，使其能夠基于最具抗性的菌株進行預測。在較高溫度下，本研究模型預測的滅活速率比McQuestin等人的模型預測值低達40%。先前一項使用相同VTEC菌株的研究也報道了McQuestin模型預測值與觀測非熱滅活速率之間的類似差異。
(iv)熱滅活速率模型
當溫度高于約47°C時，溫度本身對大腸桿菌產生致死效應，因此需要開發熱滅活模型。我們構建了一個熱滅活模型來描述溫度對大腸桿菌的致死效應。為此，將ComBase數據庫中報告的、在49°C至55°C和pH 7條件下測量的熱滅活速率，與薩拉米香腸在相同溫度和pH下報告的結果進行了比較。該數據集被用于擬合熱滅活模型的參數（表2）。
模型驗證
(i)生長速率與生長概率模型驗證
我們將本模型的生長速率預測結果與Ross等人開發的大腸桿菌生長速率模型預測進行了比較。Ross等人的模型平均預測生長速率高出約50%。這種差異可能源于數據生成方法和生長速率估算方式的不同。通過分析誤差的偏差和隨機變異組成部分，在考慮系統差異后，我們的模型表現出可比的性能。
生長概率模型的驗證表明，擴展模型（包含乳酸影響項）與觀測數據的一致性（86%）優于原始模型（77%）。預測的生長/不生長邊界條件與獨立數據集吻合良好，證實了模型的有效性。
(ii)在中試工廠生產的VTEC污染FRMS中大腸桿菌濃度的模型驗證
將EcSF工具預測的VTEC濃度與在中試工廠生產的挪威香腸和瑞典梅特沃斯特香腸整個生產和貯藏過程中觀測到的濃度進行了比較。總體而言，模型預測的濃度與所有VTEC曲線在整個FRMS制備和貯藏過程中的觀測值高度吻合，差異百分比在3%至16%之間。在發酵兼成熟期內，VTEC濃度減少了約1個對數單位。最大的VTEC減少量出現在高溫貯藏階段，如在25°C下貯藏66天后，VTEC減少量超過6個對數單位。
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