(ii)在中試工廠生產(chǎn)的VTEC污染FRMS中大腸桿菌濃度的模型驗(yàn)證
將EcSF工具預(yù)測(cè)的VTEC濃度與在中試工廠生產(chǎn)的挪威香腸和瑞典梅特沃斯特香腸整個(gè)生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中觀測(cè)到的濃度進(jìn)行了比較。總體而言，模型預(yù)測(cè)的濃度與所有VTEC曲線在整個(gè)FRMS制備和貯藏過(guò)程中的觀測(cè)值高度吻合，差異百分比在3%至16%之間。在發(fā)酵兼成熟期內(nèi)，VTEC濃度減少了約1個(gè)對(duì)數(shù)單位。最大的VTEC減少量出現(xiàn)在高溫貯藏階段，如在25°C下貯藏66天后，VTEC減少量超過(guò)6個(gè)對(duì)數(shù)單位。
(iii)整個(gè)FRMS生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中模型性能與其他建模方法的比較
我們將建模工具EcSF與MLA-RIC和MLA-EcIFM模型進(jìn)行了比較。EcSF通過(guò)求解動(dòng)態(tài)方程來(lái)預(yù)測(cè)波動(dòng)環(huán)境條件下的VTEC濃度，而MLA-RIC主要預(yù)測(cè)生長(zhǎng)導(dǎo)致的增加，MLA-EcIFM預(yù)測(cè)加工中的滅活。
模擬結(jié)果表明，對(duì)于北歐型半干制FRMS（干燥時(shí)間短），兩種方法均預(yù)測(cè)VTEC減少量較小（<1 log10）。對(duì)于干制FRMS和北美型半干制產(chǎn)品，預(yù)測(cè)減少量更大。傳統(tǒng)干制南歐型FRMS因干燥期長(zhǎng)，預(yù)測(cè)滅活最大。EcSF通常預(yù)測(cè)的VTEC減少量低于MLA-EcIFM，這源于EcSF基于抗性最強(qiáng)的O157:H7菌株進(jìn)行了校正。
統(tǒng)一從屠宰到成品（流程F1+F2）的模擬預(yù)測(cè)顯示，VTEC總減少量因肉類加工階段（F1）可能的增長(zhǎng)而低于單獨(dú)FRMS制造（F2）的預(yù)測(cè)。這表明控制初始加工環(huán)節(jié)對(duì)最終產(chǎn)品安全至關(guān)重要。
討論
動(dòng)力學(xué)和概率模型已被整合，以提供在生長(zhǎng)、存活和滅活條件范圍內(nèi)波動(dòng)環(huán)境下的動(dòng)態(tài)預(yù)測(cè)。整個(gè)FRMS制造和儲(chǔ)存過(guò)程中VTEC濃度的預(yù)測(cè)已與獨(dú)立觀察結(jié)果進(jìn)行了比較。該模型在EcSF計(jì)算工具中實(shí)現(xiàn)，該工具預(yù)測(cè)FRMS制備過(guò)程中的VTEC濃度，并允許估計(jì)達(dá)到VTEC濃度特定減少所需的儲(chǔ)存條件和制造步驟。
當(dāng)模型如本工作中那樣是經(jīng)驗(yàn)性時(shí)，預(yù)測(cè)僅當(dāng)在模型插值區(qū)域內(nèi)時(shí)才可靠。模型的插值區(qū)域在一篇里程碑論文中被定義為包含用于擬合模型的所有測(cè)量環(huán)境條件的最小凸區(qū)域。模型的插值區(qū)域不同于名義區(qū)域或獲得觀察結(jié)果的環(huán)境變量范圍的乘積。這些范圍在我們的模型補(bǔ)充材料表S1中描述。使用DMFit工具從用于擬合種群動(dòng)力學(xué)模型的非熱滅活、熱滅活和生長(zhǎng)數(shù)據(jù)集中估計(jì)了EcSF工具的插值區(qū)域，其頂點(diǎn)在補(bǔ)充材料表S4中報(bào)告。插值區(qū)域在模型名義區(qū)域內(nèi)但通常較小；通過(guò)蒙特卡洛方法估計(jì)兩者之間的重疊百分比，如先前描述。我們估計(jì)EcSF工具的插值區(qū)域是其名義區(qū)域的30%。因此，如果條件在名義區(qū)域內(nèi)隨機(jī)選擇，則存在高度外推風(fēng)險(xiǎn)。這一點(diǎn)非常重要，因?yàn)樵诓逯祬^(qū)域之外的環(huán)境條件下獲得的模型預(yù)測(cè)誤差隨著到插值區(qū)域邊緣距離的增加而越來(lái)越大。雖然FRMS制造條件的巨大變化未預(yù)期，因此可能位于EcSF工具的插值區(qū)域內(nèi)，但建議檢查形成動(dòng)態(tài)環(huán)境剖面的一組條件的頂點(diǎn)是否在模型的插值區(qū)域內(nèi)。
我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度以外的因素（如低pH和/或低a_w）抑制大腸桿菌生長(zhǎng)時(shí)，滅活速率依賴于溫度，并在較小程度上也依賴于未解離乳酸，這些因素本身并非致死性的，而不依賴于引起生長(zhǎng)抑制和/或滅活的環(huán)境因素，即pH和/或a_w。類似結(jié)果先前已在大腸桿菌中報(bào)道。我們觀察到，當(dāng)pH和/或a_w值抑制生長(zhǎng)時(shí)，大腸桿菌的滅活速率隨著溫度從2°C升高到37°C而增加。速率的增加可能是由于在此范圍內(nèi)溫度升高加速了滅活細(xì)胞過(guò)程。對(duì)于大多數(shù)細(xì)菌，酶速率在20至40°C范圍內(nèi)與溫度成比例增加。大腸桿菌在高溫度下對(duì)滅活pH和/或a_w值更敏感的另一種解釋可能是膜特性的變化。細(xì)菌耐酸機(jī)制與膜組成相關(guān)，如影響質(zhì)子滲透性的脂質(zhì)含量。耐酸性還基于通過(guò)細(xì)胞膜的有效離子傳輸以維持恒定內(nèi)部pH，以及負(fù)責(zé)修復(fù)膜的蛋白質(zhì)誘導(dǎo)。另一方面，據(jù)報(bào)道，大腸桿菌在暴露于增加滲透壓期間死亡的機(jī)制是膜變形和影響滲透性的膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的組合。因此，與相對(duì)高溫相關(guān)的膜特性擾動(dòng)可能是導(dǎo)致大腸桿菌在滅活pH和/或a_w值下存活減少的因素之一。已觀察到隨著溫度升高，大腸桿菌細(xì)胞膜中飽和脂肪酸增加同時(shí)不飽和脂肪酸減少，影響其一致性。42°C的熱休克據(jù)報(bào)道會(huì)destabilize膜，改變磷脂和脂肪酸剖面，并增加其滲透性。其他研究人員指出暴露于42°C會(huì)降低膜各向異性并增加其剛性。
在本研究中，我們觀察到未解離乳酸濃度影響生長(zhǎng)和滅活速率，并對(duì)生長(zhǎng)/無(wú)生長(zhǎng)邊界條件有相當(dāng)大的影響（見(jiàn)補(bǔ)充材料中的圖S2）。有機(jī)酸廣泛用于食品工業(yè)作為防腐劑。盡管有此用途，其抗菌作用模式仍未完全理解。普遍認(rèn)為弱酸抑制微生物生長(zhǎng)的能力與其膜滲透性相關(guān)。在pH值低于其酸性基團(tuán)pKa時(shí)，酸主要不帶電荷，以此形式酸可以自由通過(guò)細(xì)胞膜。在較高pH值時(shí)，酸主要以解離或帶電形式存在；解離酸通過(guò)膜的運(yùn)輸不能通過(guò)自由擴(kuò)散發(fā)生，但需要效率較低的二級(jí)運(yùn)輸機(jī)制。早期研究表明對(duì)細(xì)胞內(nèi)pH的影響是理解弱酸毒性的關(guān)鍵。細(xì)胞內(nèi)，乳酸解離，釋放質(zhì)子降低內(nèi)部pH和陰離子，此外特異性抑制代謝的不同方面并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生滲透效應(yīng)，導(dǎo)致生長(zhǎng)受損。可用證據(jù)表明它也可能影響膜功能。未解離乳酸已顯示破壞大腸桿菌外膜的脂多糖層，增加其滲透性。這些對(duì)細(xì)胞的作用可能有助于其他環(huán)境因素的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，并縮小生長(zhǎng)環(huán)境區(qū)域。
EcSF預(yù)測(cè)工具可用于評(píng)估制造過(guò)程和/或儲(chǔ)存期間修改、干預(yù)或意外事件對(duì)VTEC存活的影響。例如，EcSF預(yù)測(cè)將發(fā)酵溫度從20°C提高到28°C會(huì)導(dǎo)致VTEC滅活增加約100%。類似地，可以在每個(gè)特定FRMS制造過(guò)程的確切條件下評(píng)估成熟或儲(chǔ)存期間變化的影響。因此，EcSF程序可用于優(yōu)化FRMS生產(chǎn)，以實(shí)現(xiàn)相關(guān)食品安全當(dāng)局設(shè)定的大腸桿菌濃度所需減少。EcFS中實(shí)現(xiàn)的模型基于本研究發(fā)現(xiàn)的最具抗性大腸桿菌菌株，因此EcSF可能高估FRMS中的VTEC濃度。設(shè)計(jì)最佳FRMS制造和儲(chǔ)存過(guò)程以實(shí)現(xiàn)VTEC所需減少以及當(dāng)前最小化生肉中VTEC流行的努力是能夠增強(qiáng)這些肉制品安全性的方法。
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